中藥活性成分的高效分離與結構鑒定為中藥化 學生物學的重要組成部分，從傳統名貴、療效確切的 中藥中快速發現活性成分對于闡明藥效物質及其作用機制具有重要意義。龍血竭是傳統名貴藥材血竭 的代用品，其功效與血竭基本一致，具活血散瘀、定 痛止血、斂瘡生肌之功效。龍血竭基原植物百合科龍血樹屬植物劍葉龍血樹 Dracaena cochinchinensis 主要分布在東南亞各國以及我國云南、廣西等地。 現代藥理研究表明龍血竭總提物及單體成分具有腦 缺血保護、心肌保護、抗動脈粥樣硬化等廣泛的藥理 活性。

高效液相-離子阱-飛行時間質譜儀( 日本島津 公司) ; Varian INOVA-500M 核磁共振儀( 美國 Varian 公司) ; UV-2450 紫外-可見分光光度儀( 日本島 津公司) ; Nexus 470 FT-IＲ 傅立葉變換紅外光譜儀， KBr 壓片( 美國熱點尼高力公司) ; Autopol Ⅳ全自動 旋光測定儀( 美國魯道夫公司) ; JASCO 815 圓二色 譜測定儀( 日本光電株式會社) ; Milli Q 超純水機 ( 美國 Millipore 公司) ; F-1 型三用紫外分析儀( 江蘇 海門市其林貝爾儀器制造有限公司) ; DZF-6090 真 空干燥箱( 上海申賢恒溫設備廠) ; 旋轉蒸發儀( 瑞 士步琦公司) ; DLSB-5/20 低溫冷卻液循環泵( 鄭州長城科工貿有限公司) ; Buchi C-620 中壓制備液相 色譜儀( 瑞士步琦公司) ; 半制備型高效液相色譜儀 ( 日本島津公司) ; YMC-Pack ODS-A 半制備高效液 相色譜柱( 10 mm × 250 mm，5 μm) ; ODS C18 ( 40 ～ 63 μm，德國 Merck 公司) ; 薄層色譜 GF254硅膠預制 板和柱色譜硅膠( 200 ～ 300 目) 均為青島海洋化工 廠生產。提取分離所用甲醇、乙酸乙酯、石油醚等溶 劑為北京化工廠生產，均為分析純。高效液相所用 溶劑如甲醇、乙腈等為色譜純，水為超純水。 小鼠單核巨噬細胞白血病細胞 ＲAW264. 7( 北 京協和醫學院基礎醫學研究所細胞中心) ; 超凈工 作臺( 蘇州安泰空氣技術有限公司) ; CO2 培養箱 ( 日本三洋電機國際貿易有限公司) ; 倒置生物顯微 鏡( 廈門麥克奧迪實業集團有限公司) ; 多功能酶標 儀( 美國 PerkinElmer 公司) 。陽性藥吲哚美辛( 美 國 Sigma-Aldrich 公司) ; 龍血竭各萃取部位( DMSO 溶解，質量濃度 25. 0 g·L－1 ) 、化合物 1 和 2( DMSO 溶解，濃度 25. 0 mmol·L－1 ) 。 龍血竭購買于廣西中醫學院制藥廠 ( 批 號 20120404) ，為劍葉龍血樹 D． cochinchinensis 含脂木 材的乙醇提取物，標本存放于北京中醫藥大學中藥 學院中藥現代研究中心。

龍血竭成品 950 g，依次用石油醚、 乙酸乙酯回流提取( 8 L×3，每次 2 h) ，合并提取液， 減壓回收溶劑，得到石油醚提取物 65 g、乙酸乙酯提 取物 600 g、藥渣 265 g。龍血竭乙酸乙酯提取物 600 g，經硅膠柱色譜分離，依次用石油醚-乙酸乙酯( 10 ∶ 1 ～ 1 ∶3) 、二氯甲烷-甲醇( 20 ∶ 1 ～ 0 ∶ 1) 洗脫，得到 15 個流分( Fr． A ～ O) 。LC-MS 分析發現 Fr． H 為黃酮 寡聚體( 相對分子質量大于 500) 的富集部位。Fr． H( 128 g) 經過硅膠柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯 ( 3 ∶1 ～ 0 ∶1) 洗脫，得到 3 個流分( Fr． H1 ～ H3) 。Fr． H2 經中壓制備液相分離( ODS 柱，50 mL·min－1 ， 50% ～ 100% MeOH) 得到 5 個流分( Fr． H2a ～ H2e) 。 Fr． H2b 經半制備液相( 甲醇-水 45 ∶ 55) 純化，得到 化合物 1( 10. 5 mg，tＲ 63. 5 min) 。Fr． H2c 經半制備 液相( 甲醇-水 58 ∶42) 純化，得到化合物 2( 8. 2 mg， tＲ 38. 3 min) 。

測試條件 Agilent ZOＲBAX SB-C18色 譜柱( 4. 6 mm×250 mm，5 μm) ，流動相為水( 0. 1% 甲酸) ( A) 和乙腈( B) ，梯度洗脫條件如下: 0 ～ 30min，5% ～ 95% B; 流速 1 mL·min－1 。質譜分析在正 負離子模式下測定，ESI 作為離子源，檢測電壓 1. 40 kV，飛行時間區域( TOF) 壓力 1. 5×10－4 Pa; 離子阱 區域( IT) 壓力 1. 9×10－2 Pa; 干燥氣壓力 100. 0 kPa; 霧化氣流速 1. 5 L·min－1 ; 曲線脫溶劑系統( CDL) 溫 度 200 ℃ ; 掃描范圍 m / z 100 ～ 1 500。

ＲAW264. 7 細胞釋放 NO 活性篩選 活性測試在 LPS 刺激的 ＲAW264. 7 細胞 NO 釋放 模型 上 完 成，具體實驗方法參照文獻。 ＲAW264. 7 細胞用 DMEM 細胞培養液( 含 10% FBS 與 1%青-鏈霉素雙抗液) 置于 37 ℃，5%CO2 環境下 濕化培養。細胞以 2×104 個/mL 接種于 96 孔細胞 培養板后，于 37 ℃，5%CO2 培養箱中培養 24 h，用 不同濃度待測萃取部位( 5，50 mg·L－1 ) 、單體化合物 ( 4，20，100 μmol·L－1 ) 作用于 ＲAW264. 7 細胞 1 h 后，加入終質量濃度 0. 5 mg·L－1 的 LPS，24 h 后， MTT 方法檢測細胞生長狀況，NO 檢測試劑盒檢測 細胞培養液中 NO 濃度，并計算龍血竭各萃取部位 和單體化合物在沒有細胞生長抑制濃度下對 NO 分 泌的抑制率。陽性藥為吲哚美辛。

利 用 LPS 刺 激 的 ＲAW264. 7 細胞 NO 釋放模型測定龍血竭總提物、 乙酸乙酯部位、石油醚部位的潛在抗炎活性，結果表 明在低質量濃度( 5 mg·L－1 ) 下，上述部位的 NO 抑 制率分 別 為 ( 3. 9 ± 9. 9) %，( 1. 6 ± 9. 8) %，( 7. 8 ± 4. 8) %，且無明顯的細胞毒作用; 在高質量濃度( 50 mg·L－1 ) 下，龍血竭乙酸乙酯部位、石油醚部位的 NO 抑制率分別為( 25. 5±4. 5) %，( 5. 6±6. 00) %，無 明顯的細胞毒作用; 龍血竭總提物顯示出細胞毒作 用，細胞生長抑制率達( 31. 7±1. 5) %。龍血竭乙酸 乙酯部位較石油醚部位呈現出更好的抑制 NO 釋放 活性，因此對活性較好的乙酸乙酯部位進一步分離。

經過文獻調 研發現，龍血竭中簡單黃酮相對分子質量主要集中 在 250 ～ 350，黃酮二聚體相對分子質量在 450 ～ 650， 黃酮三聚體的相對分子質量在 700 ～ 800。為了得到 結構新穎的黃酮寡聚體成分，對龍血竭乙酸乙酯部 位經硅膠柱分離得到的 15 個流分進行 LC-MS 分 析。從 MS1 圖譜中可以發現 Fr． H 中主要色譜峰的 準分子離子峰信號位于 m /z 500 ～ 800，由此判斷該 流分富含黃酮寡聚體類成分。Fr． H 經硅膠柱分離得到的各個流分進一步行 LC-MS 分析，其中 Fr． H2 色譜圖呈現 2 個主要色譜峰，負離子模式下顯示準 分子離子峰分別為 799. 315 0( ［M + HCOO］－ ) 和 767. 319 1( ［M－H］－ ) ，結合二級碎片離子推測其為 黃酮三聚體類成分。選取這 2 個信號其為目標化合 物，進行導向性分離。采用 LC-MS 追蹤，進一步發 現流分 Fr． H2b，Fr． H2c 中分布有目標化合物，行半 制備液相分離純化目標成分。

本文首次利用活性追蹤并結合 LC-MS 分析的 方法，從龍血竭中快速識別、分離得到了 2 個黃酮三 聚體化合物。其中，化合物 1 為新化合物，化合物 2 為首次從該種植物中分離得到。本文是首次發現該 植物中存在二氫查耳烷環合型三聚體。化合物 1 和 2 能夠顯著地抑制 LPS 刺激的 ＲAW264. 7 細胞釋放 NO，具有潛在的抗炎作用。本研究為龍血竭藥效物 質的闡明和進一步開發利用奠定了基礎。