缺血性腦卒中最有效的治療方法是恢復梗死區 血流灌注，但由此引發的再灌注損傷問題也凸顯出 來。腦缺血再灌注損傷是一個十分復雜的過程，神 經元凋亡在其損傷過程中起著重要作用，是損傷所致 一系列有害生化級聯反應的結果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

60 只體質量 220～240 g 的 SPF 級 3 月齡雄性 SD 大鼠（三峽大學實驗動物中心，許可證號： SCXK（鄂）2012-0068），按照隨機數字表分為假手 術組、缺血/再灌注組和電針預處理組，每組 20 只。飼 養于湖北中醫藥大學實驗動物中心，室溫 20~25 ℃， 光照時間（7：00-19：00）。本實驗過程中對動物的 處置嚴格按照科技部398 號《關于善待實驗 動物的指導性意見》文件要求進行。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：p53 抗體、caspase-3 抗體（批號分 別為 sc-71820、sc-271759，Santa 公司）；TUNEL 試劑盒（批號為 11684817910，Roche 公司）；TTC 染色液（批號為 A610558-0025，Sangon Biotech 公 司）；DAB 顯色劑（K5007，DAKO 公司）。 主要儀器：3400 線栓（廣州佳靈）；RM2016病理切片機 （上海徠卡儀器有限公司 ） ； Nikon Eclipse Ti-SR 倒置熒光顯微鏡、Nikon DS-U3 成像系 統（日本尼康）；HANS-200 電針治療儀（北京華運 安特科技有限責任公司）；華佗牌毫針（0.25 mm× 13 mm，蘇州醫療用品廠）。

1.3 模型制備

缺血/再灌注組和電針預處理組，參照 Longa 等造模方法，建立大鼠右側局灶性腦缺血再灌注損傷模 型。大鼠禁食 12 h，仰臥位固定，2%戊巴比妥鈉溶液 （3 mL/kg）腹腔注射麻醉，消毒后沿頸部正中剪一 切口，長約 2 cm，向右縱行逐層鈍性分離肌肉及筋膜， 在頸前肌群近前斜角肌端處游離右側頸總動脈（CCA） 及其分支頸內動脈（ICA）和頸外動脈（ECA），術中 注意保護迷走神經。

1.4 干預方法

電針預處理組造模前先進行電針干預，參照華 興邦等制定的《大鼠穴位圖譜的研制》取穴，“百 會”位于大鼠頂骨正中，“腎俞”位于第 2 腰椎下兩 旁，“三陰交”位于后肢內踝尖直上 10 mm，其中 “百會”經皮沿腦正中線向額斜刺約 2 mm，“腎 俞”直刺約 6 mm，“三陰交”直刺 4~5 mm。同側“腎 俞”和“三陰交”接成一對電極，“百會”與其旁 開 1 cm 處提捏皮膚淺刺 1 mm 的輔助電極接成一對 電極，接 HANS-200 電針治療儀，予疏密波，頻率 2 Hz/100 Hz，強度 1 mA，通電 10 min，留針不通電 5 min，連續重復 4 次，共計 1 h。電針干預結束后 觀察 30 min 行造模手術。此過 程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后 將玻片置于 PBS（pH=7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3 次，每次 5 min。3% H2O2溶液阻斷內源性過氧化物 酶，加兔抗 p53 抗體、兔抗 caspase-3 抗體（1∶ 200）孵育過夜，滴加二抗，DAB 顯色，顯微鏡下 控制顯色時間，陽性為棕黃色，流水沖洗切片終止 顯色，脫水封片。每組 10 個樣本，每個樣本切片在 海馬 CA3 區隨機挑選 3 個 200 倍視野進行拍照，應 用 Image-Pro Plus 6.0 軟件對每張照片進行分析得出 陽性區域的累積吸光度，取其均數為該樣本的 IOD 值，IOD 值越大，陽性表達越強。

2 結果

假手術組無神經功能喪失；缺血/再灌注組神經 行為學改變明顯，大鼠左前肢明顯不能充分伸展， 或向左環行運動，出現輕度局灶神經功能喪失，或 向左側倒，出現中度局灶神經功能喪失；電針預處 理組神經行為學癥狀較缺血/再灌注組明顯減輕。 缺血/再灌注組神經行為學評分明顯高于假手術組 （P＜0.01）；缺血/再灌注組和電針預處理組神經 行為學評分分別為 2.95±0.22 和 1.75±0.64，電針 預處理組明顯低于缺血/再灌注組（P＜0.01）。見 圖 1。

假手術組大鼠右側未見腦梗死灶，缺血/再灌注 組大鼠右側腦梗死灶明顯，兩組間腦梗死百分比比 較，差異有統計學意義（P＜0.01）；與缺血/再灌注 組比較，電針預處理組大鼠右側梗死面積明顯減小 （P＜0.01）。見圖 2。缺血/再灌注組右側海馬 CA3 區 p53 陽性表達明顯增多（P＜0.01）；與缺血/ 再灌注組比較，電針預處理組右側海馬 CA3 區 p53 陽性表達量明顯減少（P＜0.01）。caspase-3 為細胞 質著色，陽性細胞呈棕黃色，其中假手術組大鼠右側 海馬 CA3 區僅有極少量神經元胞質黃染，缺血/再灌 注組右側海馬 CA3 區大量神經元胞質黃染，caspase-3 的陽性表達明顯增多（P＜0.01）；與缺血/再灌注組 比較，電針預處理組右側海馬 CA3 區 caspase-3 的 陽性表達明顯減少（P＜0.01）。

3 討論

腦缺血再灌注損傷的發生機制十分復雜，包括 炎性反應、氧化應激、細胞凋亡、興奮性毒性等， 這些因素彼此關聯，相互重疊，最終導致缺血區細 胞損傷、凋亡甚至壞死，進而引起腦功能障礙 。 研究表明，神經元凋亡是腦缺血再灌注損傷所致 一系列有害生化級聯反應（這些反應包括鈣穩態失 衡所致興奮性中毒，內質網及線粒體功能受損，自 由基氧化應激引發 DNA 損害，促凋亡基因表達的上 調，效應半胱氨酸蛋白酶的激活，核酸內切酶降解 基因組等）的結果，是腦缺血再灌注損傷的重要發 生機制之一。



 

免責聲明：文章僅供學習和交流，如涉及作品版權問題需要我方刪除，請聯系我們，我們會在第一時間進行處理。