乳酸菌作為一種重要的腸道微生物菌群在動物 胃腸道內發揮重要作用。大量研究顯示，乳酸菌在腸 道內發酵過程中能產生大量乳酸、乙酸及其他揮發性 脂肪酸，從而調控動物胃腸道內的 pH 值，以提高鐵、 磷、鈣等多種微量元素的吸收和利用。除此之外， 乳酸菌可利用糖類發酵產生大量有機酸，對維持動物 胃腸道內的微生物區系平衡和保護動物消化機能具 有不容忽視的作用; 動物胃腸道內的乳酸菌群可對多 種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌產生明顯的抑制作 用，并激活巨噬細胞、NK 細胞和 B 淋巴細胞，從而增 強機體的免疫功能。

1 材料 

1. 1 樣品

成年牛瘤胃，由黑龍江八一農墾大學生命科學與 技術學院提供。

1. 2 主要試劑

MＲS 固體/液體培養基，購自北京奧博星生物技 術有限責任公司; 乳酸菌生化鑒定管，購自青島高科 技工業園海博生物科技有限公司。

1. 3 主要儀器

潔凈工作臺( 型號為 BCN－1360B) ，購自哈爾濱 市東聯電子技術有限公司; 恒溫搖床( 型號為 BSD－ YX3600) ，購自上海旻泉儀器有限公司; 電子精密天 平( 型號為 JA2003N) ，購自上海佑科儀器儀表有限 公司; 臺式離心機( 型號為 TDL－5－A) ，購自上海飛 鴿儀器有限公司; 生物顯微鏡( 型號為 DM2500) ，購 自北京悅昌行科技有限公司; 電熱恒溫培養箱( 型號為 DＲP－9082) ，購自上海森信實驗儀器有限公司; 超 低溫 冰 箱［型 號 為 MDF － 382E ( N) ］，購 自 日 本 Hitachi 公司; 電熱恒溫水浴鍋( 型號為 HWS12) ，購 自上海一恒科學儀器有限公司; 旋渦振蕩器( 型號為 其林貝爾QL－861) ，購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司; 精密 pH 計( 型號為 PHS － 3C) ，購自上海雷磁儀器 廠; 多 功 能 酶 標 儀 ( 型 號 為 TECAN Infinite M200PＲO) ，購自瑞士 Tecan 公司。

2 方法

2. 1 菌株的分離純化與形態觀察

從瘤胃內層取樣，將樣品剪碎置無菌生理鹽水中， 離心獲取上清液。按照 1 ∶ 100 比例稀釋上清液，均勻 涂布于 MＲS 固體培養基中，37 ℃恒溫培養 24 h，挑取 生長狀態良好的單個菌落，反復劃線分離至獲得純菌 株，將其命名為 Y－A－2。觀察菌落形態，并且進行革 蘭氏染色，使用生物顯微鏡觀察細菌形態及顏色。

2. 2 生化試驗

采用直接接種法。從 MＲS 固體培養基中挑取已 純化培養的 Y－A－2 菌株接種于生化鑒定管中，用封 口膜封口。除 1%馬尿酸鈉的培養條件和培養時間 為 37 ℃ 水浴 2 h 外，其他試劑七葉苷、纖維二糖、麥 芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖、菊糖、乳 糖均為 37 ℃培養 24 ～ 48 h。根據生化鑒定管的顏色 變化來判斷乳酸菌的發酵情況: 七葉苷，陽性為黃色或 黑色，陰性為紫色或紫灰色; 纖維二糖、麥芽糖、甘露 醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖、菊糖、乳糖，陽性為 黃色，陰性為紫色或紫灰色; 1%馬尿酸鈉，陽性為深 紫色，陰性為淡紫色或無色。

2. 3 16S rＲNA 序列比對與分析

在形態分析和生化試驗基礎上，委托吉林省庫美 生物科技有限公司合成乳酸菌通用引物，序列為 27F 5' － AGAGTTTGATCMTGGCTCAG － 3' 和 1492Ｒ 5' － TACGGYTACCTTGTTACGACTT－3'，挑取已純化培養 的 Y－A－2 菌株接種于 MＲS 液體培養基中進行擴增， 委托吉林省庫美生物科技有限公司對其進行 16S rＲNA 序列檢測，將所得測序結果輸入 GenBank 中對 其進行同源性比對分析。

2. 4 生物學特性研究

2. 4. 1 最適溫度的測定

在 MＲS 液體培養基和振 蕩速度相同的情況下，挑取 Y－A－ 2 純菌株接種到 7 支試管中，然后分別于 16，23，30，37，44，51，58 ℃ 溫度條件下搖床培養 24 h，測定其 OD600值并記錄，重 復 3 次。從 7 個溫度中選取最優溫度采用二分法 ［( X±7) ，( X±3) ，( X±1) ℃，］進行再次測量，直至得 到最適溫度并記錄，重復 3 次。

2. 4. 2 生長曲線的繪制

挑取 Y－A－2 純菌株接種 到試管中，在最適溫度條件下，24 h 內每隔 2 h 測定 該菌的 OD600值 1 次并記錄，重復 3 次。2. 4. 3 pH 值的測定 挑取 Y－A－2 純菌株接種到試 管中，在最適溫度條件下，24 h 內每隔 2 h 測定該菌 的 pH 值 1 次并記錄，重復 3 次。 2. 4. 4 耐鹽性試驗將 MＲS 液體培養基中的鹽濃 度分 別 調 節 至 1. 5%、3. 5%、5. 5%、7. 5%、9. 5%、 11. 5%，每支試管分裝 3 mL，每管接種菌液 120 μL， 37 ℃厭氧培養 24 h，記錄 OD600值，重復 3 次。 2. 4. 5 耐酸堿試驗 將 MＲS 液體培養基的 pH 值調 節 至 1. 5，3. 5，5. 5，7. 5，9. 5，11. 5，每 支 試 管 分 裝 3 mL，每管接種菌液 120 μL，37 ℃ 厭氧培養 24 h，記 錄 OD600值，重復 3 次。 

3 結果與分析

用接種針從 MＲS 固體培養基上挑取已純化培養 的同一菌落接種于生化鑒定管中，置( 36 ± 1) ℃ 溫箱 中恒溫培養 36 h 后對比顏色得出結果。從糖發酵試 驗中得知，該菌株可以發酵纖維二糖、水楊苷、菊糖。 生化試驗結果。厭氧培養 24 h 后可見菌落分散，菌落呈圓形，中 等大小，凸起，濕潤，邊緣整齊，直徑為( 3± 1) mm，菌 落正面為乳白色，背面為黃色。多 次重復劃線分離純化菌株，對純化后的菌株進行革蘭 氏染色，可見該菌株為革蘭氏陽性、菌體單獨排列或 以小群聚集生長，菌體呈球狀。初 步判定此菌株為革蘭氏陽性球菌。

4 結論

本試驗從牛瘤胃中分離純化出 Y－A－2 菌株，對 該菌進行菌落形態觀察、生化試驗和 16S rＲNA 序列 同源性分析鑒定，確定 Y－A－2 菌株為乳酸片球菌。 生物學特性研究結果顯示，Y－A－2 菌株的最適生長 溫度為 26 ℃，相比于其他同種菌株，24 h 內生長較為 緩慢，具有一定的耐鹽能力，不耐強酸強堿。

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