近年來，食源性疾病屢見不鮮，其中主要的食源 性致病菌有沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和 蠟樣芽孢桿菌等，可導致腹瀉、嘔吐、痢疾等多種疾病，嚴重者可造成死亡，因此，食品產品中要求不得檢出。 常規微生物學方法檢測食源性致病菌，通常需要經過 富集培養、形態觀察、生理生化鑒定等的過程，耗時耗 力，且主觀性強，極易導致樣品菌種的流失，出現陰性 結果，不能及時的發現并控制潛在的危險。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

蠟樣芽孢桿菌 （CMCC63302）、金黃色葡萄球菌 （CMCC26003）、宋內氏志賀氏菌（CMCC51334）、鼠傷 寒 沙 門 氏 菌 （CMCC50115）、 大 腸 埃 希 氏 菌（CM－ CC44752）、銅綠假單胞菌（CICC21636）、蘇云金芽孢桿 菌（CICC22945）、綠膿桿菌（CMCC10110）、阪崎腸桿菌 （ATCC51024）、副溶血性弧菌（CICC21617）、變形桿菌 （CMCC49027）、單增李斯特菌（CMCC54001），均保存 于河北農業大學生物工程實驗室。 1.1.2 試劑 營養肉湯培養基：北京陸橋生物技術有限公司；瓊脂糖：北京全式金生物公司；agar：索萊寶生物科技有 限公司；細菌基因組 DNA 提取試劑盒：天根生化科技有限公司；2×Es Taq MasterMix（Dye）：康為世紀生物科 技有限公司；50 bp DNA Ladder：中科瑞泰生物科技有 限公司；ddH2O：河北農業大學生物工程實驗室制備。

1.2 儀器與設備

其林貝爾MTH-012 型旋渦混合儀：海門其林貝爾儀器制造有限公司；070-851 型 PCR 儀：德國 Biometra 公司； DYY-10 C 型電泳儀：北京市六一儀器廠；JY04S-3E 型 凝膠成像分析系統：北京科普爾科技發展有限公司； UV-1700 型紫外分光光度計：上海優尼科公司；K5500 型超微量核酸測量儀：北京凱奧科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的培養

分別挑取蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀 氏菌、沙門氏菌的單菌落，接種于 8 mL 滅菌的營養肉 湯培養基，37 ℃搖床 180 r/min 過夜培養。

1.3.2 模板的制備及計數

取 1 mL 過夜培養菌液，提取基因組 DNA 為模板， 具體操作方法見細菌基因組 DNA 提取試劑盒說明書。 用核酸測定儀對 DNA 濃度及純度進行測定。另取 1 mL 菌液，10 倍梯度稀釋，涂布于固體肉湯培養基中， 37 ℃過夜培養，進行平板計數。

1.3.3 引物的設計與合成

針對蠟樣芽孢桿菌的 gyrB、nheA 基因，金黃色 色葡萄球菌的 nuc、SED、MecA基因、志賀氏菌的 ipaH 基因和沙門氏菌的 ttr、sal、SiiA 基因，共設 計了 11 套引物，引物由上海生工公司合成，引物序列 及擴增片段長度等。

1.3.4 引物的篩選和確定

以11對引物分別對 4 種目的菌進行擴增，單一PCR 反應體系為：2×Es Taq Master Mix（Dye） 5 μL、20 μmol/L 上 下 游 引 物 各 0.2 μL，DNA 模 板 0.8 μL，加 ddH2O 補足到 10 μL。單一 PCR 反應程序 為：94 ℃預變性 5 min，94 ℃ 變性 30 s，梯度設置退火 溫度，退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，72 ℃再延伸 7 min，反 應 30 個循環。對 PCR 產物進行凝膠電泳分析，選擇擴 增條帶單一且大小不同、退火溫度相似的引物，確定 為多重 PCR 引物組。

2 結果與分析

蠟樣芽孢桿菌 gyrB 引物對在 52.5、55.7 ℃范圍內條帶明顯，片段長 246 bp；金黃色葡萄球 菌 nuc 引物對在 52.5 ℃處有單一明亮條帶，片段長 166 bp；志賀氏菌的 ipaHⅠ引物對在 52.6 ℃處單一明 亮條帶，片段長 210 bp，ipaH Ⅲ引物對在退火范圍內 條帶單一，片段長 65 bp；沙門氏菌 SiiA 引物對在梯度 退火溫度下條帶單一明亮，片段長 107 bp，退火溫度 相近且擴增出的片段長度不同，有利于多重 PCR 擴 增結果的判斷，最終選擇 gyrB、nuc、ipaHⅢ、SiiA 引物 對為多重 PCR 反應的引物組。當退火溫度在這個范圍內間均能得 到 4 條目的帶，且條帶區間明顯，故證明本研究建立的 多重 PCR 體系，可特異性擴增出目的條帶，且其大小 與預期擴增基因片段大小一致，但在 53.9 ℃之前條帶 略暗，退火溫度為 53.9 ℃ 時條帶更加清晰明亮，因此，選定 54 ℃作為多重 PCR 的最適退火溫度。但多重 PCR 擴增的志賀氏菌 65 bp 與金黃色葡萄球菌 166 bp 條帶相對暗一些，故對 4 組引物對的加入量進行優化。測得 1mL 蠟樣芽孢桿菌的核酸濃度為 52.649ng/μL， 對應菌落濃度為 1.5×107 CFU/mL；1mL 金黃色葡萄球菌的 核酸濃度為 14.245 ng/μL，對應菌落濃度為 108CFU/mL； 1 mL 志賀氏菌的核酸濃度為 357.78 ng/μL，對應菌落 濃 度 為 108 CFU/mL；1 mL 沙門氏菌的核酸濃度為 108.32 ng/μL，對應菌落濃度為 1.05×108 CFU/mL。用 ddH2O 10 倍梯度稀釋提取的 DNA 模板，取 0.8 μL 進 行多重 PCR，測定其檢出限。

3 討論

目前，普通 PCR 技術在食品檢測、疾控檢測中， 已經相當成熟，相對于傳統的生化特性檢測，有著快 速、特異、靈敏度高的特點。在簡單的 PCR 基礎上，多 重 PCR 融合了普通 PCR 方便、快捷的優點，加入多個 引物對，可進行多個菌種多個樣品的快速分析，簡單 易操作，無需昂貴的儀器和專業的實驗人員，也可進 行準確的分析，為快速發展的食品檢測行業，提供了 很好的理論和技術基礎。由于多重 PCR 是在同一反 應下進行的，節約成本，因此相對于常規的單重 PCR 來說，大大縮短的檢測時間，提高了檢測效率。食 品檢測的快速發展，多重 PCR 方法以其特異性強、靈 敏度高等優點被廣泛應用于食源性致病菌的快速檢 測中。



 

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